Virulence Factors of Aeromonas spp.

Rincón V. Gresleida¹; Fuenmayor B. Alisbeth¹; Castellano G. Maribel²; Barrios U. Rosana³; Colina Ch. María³; Nuñez F. Génesis³.

¹ Bacteriología Clínica. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela. ² Bacteriología. ³ Licenciadas en Bioanálisis General. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela.

Autor de correspondencia: Gresleida Rincón. E-mail: gresle61@hotmail.com

Resumen

Algunas especies de Aeromonas han emergido como patógenos importantes, asociadas al desarrollo de infecciones gastrointestinales y extraintestinales. El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial de virulencia de cepas de Aeromonas procedentes de vegetales. Se analizó los factores de virulencia: DNAsa, lecitinasa, caseinasa, gelatinasa, β-hemolisinas y hemaglutininas, en 59 cepas de A. hydrophila y 61 de A. caviae, aisladas de cilantro, perejil y lechuga, comercializados en Maracaibo. Los resultados fueron analizados mediante el estadístico χ². Los factores de virulencia estudiados fueron expresados por más del 80% de las cepas. Cuatro de los 6 factores fueron expresados en mayor proporción por las cepas de A. hydrophila, aunque la diferencia entre las especies sólo resultó significativa para la expresión de caseinasa (94,9% vs 72,1% p<0,05). Todas las cepas exhibieron actividad de DNAsa. La expresión de lecitinasa resultó ligeramente superior en las cepas de A. caviae (p > 0,05). Se evidenció una diferencia significativa en el número de factores de virulencia expresado por las dos especies, siendo mayor para A. hydrophila (p < 0,05). La expresión de un número elevado de factores de virulencia por las cepas de Aeromonas analizadas, permite atribuirles un potencial de patogenicidad similar al descrito en las cepas procedentes de infecciones humanas.

Palabras clave: Aeromonas spp, factores de virulencia, patogenicidad, vegetales tipo hoja, gastroenteritis

Abstract

Some species of Aeromonas have emerged as important pathogens associated with the development of gastrointestinal and extra-intestinal infections. The objective of this study was to evaluate the potential virulence of Aeromonas strains from vegetables. Virulence factors were analyzed: DNase, lecitinasa, caseinase, gelatinase, hemolysines and hemaglutinies, in 59 strains of A. hydrophila and 61 of A. caviae, isolated from coriander, parsley and lettuce obtained in establishments in Maracaibo city. The results were analyzed through statistics χ². The virulence factors studied were expressed for more of the 80% of the strains. Four of the 6 factors were expressed in greater proportion in Aeromonas hydrophila strains, although the difference between the species only significant in for caseinase expression (94.9% vs 72.1%, p <0.05). All strains exhibited DNase activity. The lecitinasa expression result slightly higher in A. caviae strains (p> 0.05). A significant difference was evident in the number of virulence factors expressed by the two species, being higher for A. hydrophila (p <0.05). The expression of a large number of virulence factors the analyzed Aeromonas strains, allow to attribute a potential of pathogenicity to the strain of human infections.

Recibido 03-10-16 / Aceptado 26-10-16

Introducción

El género Aeromonas está conformado por bacilos Gram-negativos, fermentadores rápidos de la glucosa, oxidasa-positivos y anaerobios facultativos, que habitan en ecosistemas acuáticos naturales (lagos, ríos, aguas subterráneas y ambientes marinos con bajas concentraciones de sodio) o en aguas acumuladas artificialmente (represas, plantas de tratamiento, sistemas de distribución y otras)(1). También pueden encontrarse en el suelo, en los sedimentos y en algunos alimentos, incluyendo carne, pescado, vegetales y leche cruda (2).

Durante las últimas dos o tres décadas estos microorganismos han ido emergiendo como patógenos importantes para el humano (3), asociados al desarrollo de una variedad de infecciones tanto intestinales como extraintestinales (4). Actualmente el género incluye alrededor de 30 especies y 12 subespecies, algunas de las cuales han sido catalogadas por la Organización Mundial de la Salud como microorganismos de riesgo II (2).

El rol etiológico de Aeromonas en infecciones extraintestinales, especialmente a nivel de piel y tejidos blandos, es indiscutible. Por otra parte, su papel enteropatógeno ha sido ampliamente debatido, a pesar de que en estos microorganismos se ha descrito una variedad de factores de virulencia, los cuales podrían participar en la patogénesis tanto de las infecciones sistémicas como de las infecciones intestinales que se le atribuyen. Entre tales factores se encuentran enzimas extracelulares (DNAsa, gelatinasa, proteasas, hemolisinas), además de citotoxinas, enterotoxinas, hemaglutininas y otros, que le confieren al microorganismo el potencial para invadir, adherirse y lesionar los tejidos del hospedador (5,6).

Durante las últimas décadas se han venido presentado cada vez mayores evidencias en favor de la participación de algunas especies de Aeromonas como verdaderos agentes etiológicos de gastroenteritis (7,8), con una mayor importancia para los niños, los adultos mayores de 60 años y los viajeros (1). Pese a ello, los reportes referentes a la prevalencia de estos microorganismos en pacientes con diarrea aguda son escasos. Probablemente, esto se deba a que aún no se ha generalizado la implementación de una metodología dirigida a su investigación, así como la de otros bacilos oxidasa positiva, en los cultivos rutinarios de materia fecal (2).

Algunos estudios que documentan la importancia de Aeromonas como patógeno intestinal demuestran que, en algunas regiones, la frecuencia de estos microorganismos puede ser similar, o inclusive superior, a la de los enteropatógenos convencionales como Salmonella y Shigella (9). En los Estados Unidos, las Aeromonas dan cuenta de aproximadamente el 13% de los casos de gastroenteritis (10). En Nigeria, constituyen los enteropatógenos más frecuentemente aislados durante las épocas de lluvia (9). En la India, se reporta el aislamiento de Aeromonas en un porcentaje importante de los pacientes hospitalizados con diarrea aguda (1). En Cuba, estos microorganismos ocupan el cuarto lugar entre los enteropatógenos bacterianos más frecuentes (2).

En Venezuela, específicamente en el Estado Zulia, una región con fuerte influencia lacustre, las especies de Aeromonas han sido reportadas con una frecuencia elevada en individuos con diarrea, ocupando el primer o segundo lugar entre los patógenos entéricos bacterianos más prevalentes, tanto en niños como en adultos (11,12). Resultados similares se derivan también de un estudio poblacional realizado en indígenas Añu de la Laguna de Sinamaica (13). Aeromonas caviae y A.hydrophila reiteradamente han quedado registradas como las especies más frecuentes en las muestras fecales analizadas en la región (11-13), en concordancia con diversos estudios que le atribuyen a esas especies, así como A. veronii biovar sobria, un verdadero potencial enteropatógeno (2,14-18).

Como se mencionó anteriormente, se ha documentado la presencia de miembros del género Aeromonas en una variedad de alimentos frescos, entre los que se incluyen vegetales como espárragos, brotes de soja y alfalfa, brócoli, repollo, coliflor, lechuga, cilantro, perejil, zanahorias, espinacas, tomates y pepino, entre otros (19,20). Un estudio realizado en la ciudad de Maracaibo (estado Zulia), posicionó a las Aeromonas, y especialmente a las especies A. caviae y A. hydrophila, como los enteropatógenos más frecuentemente aislados a partir de vegetales tipo hoja como cilantro, lechuga y perejil (21). Adicionalmente, en los vegetales tipo hoja contenidos en comidas rápidas expendidas al oriente del país, también se ha registrado una elevada frecuencia de aislamiento de estos microorganismos, especialmente de las especies A. schubertii y A. caviae (22).

Por lo anteriormente expuesto, el presente trabajo se realizó con el propósito de identificar la expresión fenotípica de algunos factores de virulencia, en cepas de Aeromonas spp. procedentes de vegetales tipo hoja, expendidos libremente en mercados populares y supermercados del municipio Maracaibo, Estado Zulia, y comparar la frecuencia de éstos en las especies A. hydrophila y A. caviae, como una contribución al discernimiento del papel enteropatógeno de estos microorganismos, así como del riesgo potencial al que se expone la población que adquiere y consume los vegetales expendidos en los mercados de la región.

MATERIALES Y METODOS

El tipo de investigación, corresponde al tipo descriptivo transversal, que es un estudio el cual está diseñado para medir la prevalencia de una exposición, en una población definida y en un tiempo específico.

Cepas bacterianas

Para el desarrollo de la investigación, se analizaron 120 cepas de Aeromonas spp. que fueron aisladas e identificadas en un estudio previo, a partir de muestras de cilantro, perejil y lechuga, comercializados en diferentes mercados de la ciudad de Maracaibo, estado Zulia. (Tabla 1) Para el aislamiento de las cepas se emplearon los medios de DNAsa-Azul de Toluidina-Agar y Agar-Ampicilina-Almidón. Para la identificación hasta el nivel de especie se siguió la metodología recomendada por Abott y cols .basada en pruebas bioquímicas (23). Estos procedimientos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Bacteriología de la Escuela de Bioanálisis de la Universidad del Zulia. Las cepas fueron conservadas a temperatura ambiente, en tubos con Agar Nutritivo sellados con parafina, para los estudios posteriores.

Tabla 1. Especies de Aeromonas estudiadas y vegetales de procedencia

Detección fenotípica de factores de virulencia

Durante el periodo comprendido entre Octubre y Diciembre de 2015, se llevó a cabo el procesamiento de las cepas, para la investigación de algunos factores de virulencia. Para ello, se verificó su pureza y su viabilidad, mediante subcultivo a placas de Agar Mc Conkey incubadas por 24 horas, en aerobiosis, a 35°C. Las colonias, fermentadoras o no de la lactosa, fueron sembradas en agar nutritivo para verificar que presentaran una reacción positiva a la prueba de la oxidasa. A partir de las cepas consideradas aptas, se llevó a cabo la investigación fenotípica de los siguientes factores de virulencia: producción de las enzimas extracelulares DNAsa, caseinasa, gelatinasa, lecitinasa y β-hemolisinas, así como la presencia de hemaglutininas.

Análisis Estadístico: Para el análisis estadístico de los datos se aplicó la prueba de χ² (chi cuadrado) con un nivel de confiabilidad de 95% (p< 0,05). Para ello se empleó el software estadístico SPSS (StatisticalProduct and ServiceSolutions), versión 20.

Resultados

La Figura 1 muestra la positividad de las cepas de Aeromonas para los diferentes factores de virulencia analizados. Se observa que todos los factores fueron expresados en un porcentaje superior al 80%, predominando la positividad para las enzimas DNAsa (100%) y gelatinasa (98,33%). Cabe destacar que la actividad de hemaglutinación de eritrocitos humanos, evidenciada en 98 de las 120 cepas estudiadas (81,66%), resultó resistente a manosa en la mayoría de los casos (85 cepas; 86,7%).

Al analizar la distribución por especie, de la positividad para cada uno de los determinantes de virulencia (Gráfico 2), se observa que 4 de los 6 factores estudiados, caseinasa, gelatinasa, betahemolisinas y hemaglutininas, fueron expresados con mayor frecuencia por las cepas de A. hydrophila, aunque la diferencia entre especies sólo resultó significativa para la actividad de caseinasa (94,9% vs. 72,1%; p < 0,05). Como se evidenció en la figura 1, la enzima DNAsa fue expresada por la totalidad de las cepas de ambas especies. Únicamente la actividad de lecitinasa se expresó con mayor frecuencia en la especie A. caviae (p > 0,05). En cuanto a la actividad hemaglutinante, ésta resultó predominantemente manosa-resistente en ambas especies de Aeromonas (88,9% en A. hydrophila y 84,0% en A. caviae; p > 0,05).

La figura 3 presenta el número de factores de virulencia expresado por las cepas de las dos especies de Aeromonas estudiadas. Aunque en general, la mayoría de las cepas estuvieron dotadas de la capacidad para expresar entre 4 y 6 de los factores estudiados, es importante resaltar que un 96,5% de las cepas de A. hydrophila resultaron positivas para 5 ó 6 de ellos, en comparación con sólo un 68,9% de las cepas de A. caviae con ese resultado. Esta diferencia entre las especies fue estadísticamente significativa (p < 0,05).

DISCUSIÓN

En algunas especies del género se ha identificado un gran número de moléculas estructurales y enzimas extracelulares que parecen desempeñar un papel importante en la patogenia de las infecciones intestinales (34) y sistémicas (35). Entre los factores de virulencia asociados a enteropatogenicidad se incluyen productos extracelulares como hemolisinas, citotoxinas, proteasas, lipasas, endotoxinas, enterotoxinas, además de moléculas estructurales como hemaglutininas y adhesinas (36,37). Se han realizado numerosos estudios para identificar y caracterizar esos determinantes de virulencia. Las evidencias reunidas hasta ahora relacionan la producción de tales factores con un mayor potencial de patogenicidad en la cepa infectante (34), aun cuando el papel preciso de cada uno de ellos no ha sido completamente dilucidado (38).

En este estudio, que analizó cepas de A. hydrophila y A. caviae aisladas de vegetales tipo hoja, los resultados globales coinciden con lo reportado en cepas provenientes de muestras clínicas intestinales y sistémicas, así como también en muestras de aguas y alimentos, en el sentido de que la mayoría de los factores de virulencia fueron expresados con una alta frecuencia (39-41). La variabilidad evidenciada entre los diferentes estudios para cada factor en particular, podría guardar relación con la presión selectiva a la que se encuentran sometidas las cepas en los diversos ecosistemas de cada área geográfica.

Aun cuando todos los factores fueron expresados por más del 80% de las cepas, los resultados más altos correspondieron a la actividad de nucleasa y gelatinasa con cifras iguales o cercanas al 100%.Un predominio en la expresión de actividad de nucleasa ha sido reportado también en cepas clínicas de Aeromonas (100% en cepas provenientes de pacientes septicémicos y 88,9% en enfermedad diarreica aguda) (40,42), así como en cepas obtenidas de muestras de agua potable (94%) (41) y alimentos (87%) (25). A pesar de que se considera a A. hydrophila como la principal especie productora de nucleasas, y algunos estudios reflejan una menor expresión de estas enzimas en A. caviae (25,43), en este estudio ambas especies presentaron un comportamiento similar en cuanto a este factor de virulencia en particular.

En las especies de Aeromonas se han descrito al menos tres enzimas con actividad DNAsa, pero no se ha determinado fehacientemente la posible función que éstas desempeñan en la patogenia. Sin embargo en otros géneros bacterianos como Streptococcus, las nucleasas extracelulares son consideradas de gran importancia para el establecimiento y desarrollo de la infección (44). Es posible que la DNAsa participe en la invasión celular, y que al igual que otros factores de virulencia producidos por las especies de Aeromonas, cumpla una función importante como enzima nutricional, contribuyendo a proporcionarle a la bacteria una fuente de compuestos ricos en carbono y nitrógeno (41).

Aeromonas produce al menos tres tipos de proteasas, capaces de degradar diferentes compuestos como albúmina, fibrina, gelatina, caseina y elastina (4,44). La expresión de enzimas proteolíticas resultó marcadamente frecuente en las cepas de Aeromonas provenientes de vegetales (98% y 83% de positividad para gelatinasa y caseinasa, respectivamente).Las cepas clínicas han demostrado también presentar actividad proteolítica de tipo gelatinasa con una elevada frecuencia (84% en cepas sistémicas, 61-100% en cepas enteropatógenas) (35,45). En cepas de efluentes de aguas de desecho tratadas en África, todas las cepas resultaron productoras de proteasas con actividad de caseinasa y 88% resultaron positivas para gelatinasa (46). En Colombia, el 96% de las cepas aisladas del agua de consumo evidenciaron actividad proteolítica de tipo caseinasa, en comparación con sólo un 63% en las cepas provenientes de pescado (25,41).Se ha sugerido que las enzimas proteolíticas excretadas por Aeromonas spp. desempeñan un papel importante en la invasividad y en el establecimiento y mantenimiento de la infección, porque además de proporcionar nutrientes para la proliferación celular, contribuyen a la evasión inicial de las defensas del hospedador, jugando un papel clave en la evolución de las infecciones humanas a nivel de piel y tejidos blandos (6,38,44).

Es importante resaltar que, en esta investigación, sólo la expresión de actividad caseinolítica resultó diferente entre las especies A. hydrophila y A. caviae, siendo inferior en esta última (95 vs. 72%, p < 0,05), aunque la actividad de gelatinasa fue la segunda más frecuente en A. caviae (96,7%) luego de la actividad de nucleasa. Resultados similares para actividad caseinolítica, aunque de menor rango, se reportan en las cepas de Aeromonas obtenidas de pescado: 50% en A. hydrophila y 0% en A. caviae (25). En cepas ambientales de A. hydrophila se describe una actividad menor para ambas enzimas que las obtenidas en el presente estudio (55% para caseinasa y 0% para gelatinasa) (47). Por otra parte, se ha reportado actividad de gelatinasa y caseinasa en el 50-100% de las cepas tanto de A. hydrophila como de A. caviae aisladas de pacientes con diarrea, pero con resultados variables para las dos proteasas y las dos especies en cada estudio (43,45,47). Los resultados demuestran la necesidad de realizar las comparaciones entre los diferentes estudios de una manera muy estricta, tomando en cuenta los sustratos específicos de acción para cada enzima, debido a las implicaciones que cada una tiene para la virulencia de la cepa. Por ejemplo, se ha demostrado que una proteasa secretada por A. hydrophila, que posee una alta actividad elastolítica, y que no pudo ser evaluada en el presente estudio, debe ser considerada como un verdadero factor de virulencia para esta especie (38). La caseinasa, por su parte, parece tener un rol en la activación de otras enzimas patogénicas como la hemolisina (48).

En relación a la producción de lipasas, en este estudio se evaluó la actividad de la fosfolipasa C con actividad de lecitinasa, la cual ha sido señalada como un verdadero factor de virulencia para las Aeromonas mesófilas, con un importante efecto citotóxico (49). Las fosfolipasas bacterianas están involucradas en diferentes procesos patogénicos, actúan como hidrolasas sobre los lípidos de las membranas celulares y frecuentemente se asocian a la producción de daño intestinal (2,45,49). En estudios previos se ha reconocido a la A. hydrophila como una importante productora de lipasas (45). En esta investigación, las dos especies analizadas produjeron lecitinasa en un elevado porcentaje, que resultó ligeramente mayor en A. caviae (86,9 versus 74,6%, p > 0,05). Cabrera y cols. reportan hallazgos similares en cepas aisladas de muestras clínicas (75% en A. hydrophila vs 100% en A. caviae (35). En pacientes cubanos con enfermedad diarreica aguda, donde se obtuvo un predominio de aislamiento de A. caviae, la proporción de cepas productoras de lecitinasa alcanzó un 83,3% (40). Los resultados del presente estudio y los reportes de otros autores corroboran que la lecitinasa parece ser expresada por todas las especies de Aeromonas (50).

Entre los factores de virulencia analizados, la actividad hemolítica parece estar muy relacionada con la enterotoxicidad de las Aeromonas. En algunas especies se ha descrito la presencia de los genes aer y hlyA, responsables de la producción de las toxinas aerolisinas y hemolisinas, respectivamente. La aerolisina es uno de los principales factores de virulencia en cuadros de gastroenteritis, favoreciendo la invasión de las células epiteliales (46). Las cepas de las dos especies aquí analizadas demostraron una alta capacidad para hemolizar los eritrocitos de carnero (superior al 75%). Las cifras reportadas tanto en muestras ambientales como en muestras clínicas son muy diversas, pero la tendencia es a resultar similar para ambas especies o superior en A. hydrophila: en cepas aisladas de pescado aproximadamente 50% para ambas especies (25), en muestras de aguas desde 16% hasta 67% (46-47), en algunos estudios con cepas clínicas, entre 96 y 100% para ambas especies (35,51,52). En reportes posteriores, los resultados para β-hemolisinas en cepas de pacientes con enfermedad diarreica varían desde 20% en Italia, 24% en Cuba y Brasil, 38% en nuestro país, 81% en otro trabajo cubano, hasta cerca del 100% en Sur África (40,47,52-55). En Venezuela, Longa y cols. reportan mayor frecuencia de actividad hemolítica en A. hydrophila que en A. caviae (56% vs 26%) (55). Resultados similares se reportan en Brasil para la presencia del gen aer (45). Algunos autores han evidenciado una fuerte correlación entre la actividad de hemolisina y la producción de enterotoxinas, por lo que se ha considerado este hallazgo como una prueba del poder enteropatógeno tanto de A. hydrophila como de A. caviae (35,51,52,56).

Tanto en las cepas de Aeromonas de origen clínico como en las de procedencia ambiental se ha descrito la presencia de dos tipos de fimbrias, unas cortas rígidas que suelen encontrarse en número elevado sobre la superficie celular y otras largas, onduladas y flexibles, más escasas. Estas últimas se consideran hemaglutininas y juegan un papel importante en la adhesión bacteriana a las células epiteliales, en la formación de biofilm y en la motilidad (57). Al igual que se describe en las cepas enteropatógenas de Escherichia coli, las fimbrias con actividad hemaglutinante pueden ser inhibidas en presencia de algunos carbohidratos como manosa, fructosa o galactosa. La hemaglutinación mediada por fimbrias manosa-resistentes parece estar más relacionada con enteropatogenicidad (58).

Finalmente, las cepas de Aeromonas pertenecientes a las dos especies analizadas en el presente estudio, expresaron como mínimo dos de los factores de virulencia investigados, y la mayoría de ellas exhibió actividad para 5 o 6 factores, lo que indica que estas cepas poseen el potencial suficiente para causar daño en un hospedador susceptible. Estos resultados concuerdan con diversos estudios que han demostrado al menos un factor de virulencia detectable en las diferentes especies de Aeromonas procedentes de muestras de pacientes con diarrea o sepsis, así como de agua y alimentos (55,56). El hallazgo de la expresión fenotípica de un número significativamente mayor de factores en la especie A. hydrophila, en comparación con A. caviae, refleja la tendencia general de múltiples reportes (41,56).

En conclusión las cepas de Aeromonas hydrophila y A. caviae provenientes de vegetales tipo hoja expendidos en mercados populares de Maracaibo, exhibieron una alta frecuencia y variedad de marcadores fenotípicos de virulencia, algunos de ellos altamente relacionados con la patogenicidad de estos microorganismos en el hospedador humano. Aunque es necesario reconocer, que en este estudio, no se evaluaron factores directamente asociados a enteropatogenicidad, como la producción de enterotoxinas y citotoxinas, la elevada proporción de cepas con actividad de hemolisina, proteasas y hemaglutininas, tres factores de virulencia que en diversos estudios han presentado una fuerte correlación con la enterotoxigenicidad, sugiere, que estas cepas poseen el potencial necesario para desencadenar infecciones intestinales en el consumidor. De igual forma, la expresión de un número elevado de factores de virulencia por las cepas de Aeromonas analizadas, permite atribuirles un potencial de patogenicidad similar al descrito en las cepas procedentes de infecciones humanas. Los resultados sugieren que los vegetales tipo hoja expendidos en la región, vehiculizan bacterias con un potencial patogénico suficiente como para representar un riesgo importante para la salud del consumidor.

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